การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์สัตว์ ตรวจวัดการมีชีวิตของเซลล์
เซลล์ที่ที่มีชีวิตจะมีเอ็มไซด์ succinate dehydrogenase เอ็มไซด์นี้จะอยู่ในส่วนของไมโตคอนเดรียจะไปเปลี่ยนสาร tetrazolium salt MTT เป็นสารสีเหลืองทำให้เกิดผลึกสารฟอมาซานซึ่งมีสีม่วงโดย ทำการละลายผลึกด้วยตัวทำละลาย เช่น DMSO หรือไอโซโพรพานอล (Isopropanol)
MTT (colorimetric assay) ซึ่งหลักการและวิธีของการวัดคือ การวัดสภาวะ reduction environment (Mitochondrial reductase) ของ mitochondria ในเซลล์
เซลล์ที่นำมาทดสอบอาจเป็นเฮ็ทพีเร้นเซลล์หรือซอร์ทเท็นเซลล์ก็ได้ โดยเราจะเลี้ยงเซลล์ให้อยู่ในช่วงของ log phase
- ดูดอาหารเลี่ยงเซลล์ทิ้ง
- เติม 0.05% trypsin (0.025-0.25% )ปริมาตร 1 ml
- ดูด trypsin ทิ้ง
- เติมอาหารเลี้ยงเซลล์
- ดูดเซลล์ใส่หลอดทดลอง
- นับเซลล์โดยใช้ Haemacytometer (การใช้ haemacytometer นับจำนวนจุลินทรีย์ https://www.youtube.com/watch?v=y4G8hX67oAY )
การเตรียมสารทดสอบเพื่อเติมลงในเซลล์ทดสอบ ซึ่งชนิดของตัวอย่างสารทดสอบ
ซึ่งสารตัวอย่างจะต้องปราศจากเชื้อโดยจะกรองผ่านเมมเบรน 0.2 ไมโครเมตร
หลังจากนั้น เราจะนำสารทดสอบและเซลล์ไปบ่ม ที่ 37 องศาเซลเซียส 5% คาร์บอนไดออกไซด์ ซึ่งระยะเลาในการบ่มขึ้นอยู่กับกลไกในการออกฤทธิ์ และความเสถียรของสารตัวอย่าง
ขั้นตอนต่อมาคือการเติมสารละลาย MTT
เราจะเติมสารละลาย MTT แข้มข้น 5 mg/ml ปริมาตร 10 ไมโครลิตร จากนั้นนำไปบ่มที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 4 ชั่วโมง จากนั้นดูดอาหารเลี่ยงเซลล์ทิ้ง แล้วเติมสาร DMSO 100-150 ไมโครลิตร วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 540 นาโนเมตร
ในการละลายผลึกฟอมาซานเราจะทำการละลายผลึก formazan ด้วย DMSO จะได้สารละลายสีม่วง หลุมที่เซลล์ตายจะแสดงสีใสในขณะที่หลุมเซลล์เป็นจะแสดงสีเข้ม
ขึ้นตอนสุดท้ายเรามาทำการวัดสีด้วยไมโครไตเตอร์ Plate reader ที่ 540 nm
เพื่อวัดค่าความเป็นพิษ โดยจะคำนวณจากค่า IC50 ซึ่งค่า IC50 หรือค่า หรือ Inhibitory Concentration (IC) คือ ค่าความเข้มข้นที่สารนั้นมีประสิทธิภาพในการยับยั้งที่ X% เป็นค่าที่แสดงความเข้มข้นของสารตัวอย่างที่ทำให้ความมีชีวิตของเซลล์ลดลงเป็น 50%
